永历帝名义上的统治范围扩大到云贵、两广、湖南、江西、四川、山陕、甘肃等地。但南明一直以来存在的内讧传统从未消失，永历政权官员鄙视、猜忌归附的大顺农民军，和反正的金声桓、李成栋等部，内部矛盾依旧严重、不能团结一致，抵抗清军。至南明永历四年、清顺治七年（1650年）正月，金声桓、李成栋、耿献忠、姜镶先后败亡，大顺农民军也脱离永历政权，独自在荆楚西部建立抗清根据地，永历政权的重要势力范围广西也被清军攻克，南明政权的疆域大大萎缩，退到云贵、四川南部一带，永历帝此时已经逃到距离安南不到三百里濑湍（广西崇左），即将逃亡国外。
幸好天无绝人之路，南明永历五年、清顺治八年（1651年），大西军农民军余部也加入了南明政权，协助永历帝抗清，首领孙可望将永历帝从广西接到贵州，安置在安龙府（贵州安龙县）（实际是软禁）。在安龙，永历帝过了三年多虽不自由、但相对安稳平静的生活。南明永历七年、清顺治十年（1653年），大西军李定国部对清军发动反击，先后取得桂林、衡阳大捷，清定南王孔有德、敬谨亲王尼堪先后被李定国击毙，南明收复了湖南、广西、江西、川南等地，清廷朝野震动，慑于李定国威名，几乎要割云贵湘赣粤桂闽七省和南明议和，永历政权的形势一度恢复大好局面。
但是，南明的内讧传统又又又一次展现，南明永历八年、清顺治十一年（1654年），永历政权的实际控制者孙可望野心膨胀、想要自立为帝，因此和坚持拥立永历帝的李定国产生矛盾，孙可望欲暗杀李定国，独揽大权，李定国则在永历帝血诏的恳求下，准备进军贵州，救出皇帝。南明永历九年、清顺治十二年（1655年），李定国出兵安龙府，从孙可望的势力范围中解救出永历帝，辗转护送到云南昆明府。
孙可望大怒，于南明永历十一年、清顺治十四年（1657年）八月发兵攻打李定国，两军会战于曲靖交水河畔，孙可望部军队不愿意和李定国对抗，因此纷纷阵前倒戈，孙可望狼狈地率数十亲信逃走。之后，孙可望在贵州穷途末路，只得向清军投降，清朝封孙可望为义王，孙可望则将他所知道的永历政权内部情况和军事部署全部告知清朝，使清军为接下来的出兵云贵、彻底消灭永历政权做好了充足的战前准备。
南明永历十二年、清顺治十五年（1658年）四月，清军发起对南明永历政权最后的进攻，兵分三路，从湖广、四川、广西合围云贵。在清军的猛烈进攻下，遵义、贵阳、独山先后失守，贵州全境失陷。南明永历十二年、清顺治十五年（1658年）十二月十三，抵抗清军受挫的李定国从贵州退回滇都（昆明）。十二月十五，在李定国的保护下，永历帝率大部分永历朝臣、内宫眷属、侍卫离开滇都，向滇西撤退。
流亡朝廷先逃到永昌府（云南保山），又退至腾越（云南腾冲）。永历政权撤离后，清军于南明永历十三年、清顺治十六年（1659年）正月初三进入昆明。南明永历十三年、清顺治十六年（1659年）二月，李定国在永昌（云南保山）发动了磨盘山战役，重创追击的清军，但自身也损失惨重，无力继续保护永历帝君臣。在腾越的永历帝胆战心惊、不敢再留在国内，于是放弃腾越，逃到了缅甸境内。
至此，南明永历政权失去了在国内的所有立足点，实际上灭亡。李定国率部坚持在边境一带作战，抗击清军，之后又数次出兵入缅，想接回永历帝，但都不能成功。南明永历十五年、清顺治十八年（1661年）三月，缅王莽白发动咒水之难，将永历帝身边随侍的官员、护卫、侍从全部杀死，软禁了永历帝及其家眷。十二月，在清军扬言要入缅武力索取永历帝的情况下，莽白迫于压力，将永历帝以及全部南明皇室成员交给了清军。
南明永历十六年、清康熙元年（1661年）三月十三，永历帝在清军的押送下回到昆明，一个月后，四月十五，清军将永历帝与皇太子朱慈煊杀害于篦子坡，最后的南明皇统就此断绝，永历帝遇害时，年四十岁。当年六月，坚持抗清的李定国在驻军地景线（一说勐腊）得知永历帝遇害后，悲愤忧虑不已，于六月二十七病逝；之前的五月初一，明郑延平政权首领延平王郑成功也因为皇帝的遇害、以及郑氏家族的内讧而数痛攻心，不幸病逝。
永历帝遇害七个月后，当年十一月，继任延平王郑经追谥永历帝为“为应天推道敏毅恭俭经文纬武礼仁克孝匡皇帝”，上庙号“昭宗”。南明四代皇帝中，弘光帝朱由崧、永历帝朱由榔都是崇祯帝的堂兄弟，弘光帝是堂兄，比崇祯帝大三岁；永历帝是堂弟，比崇祯帝小十二岁，他们都是明神宗万历帝朱翊钧的皇孙（崇祯帝是明神宗皇长子泰昌帝朱常洛第五子，弘光帝是明神宗第三子福忠王朱常洵长子，永历帝是明神宗第七子桂端王朱常瀛第四子）。
另外两位南明皇帝：隆武帝朱聿键、绍武帝朱聿鐭，他们是亲兄弟俩，都是明朝宗室中的远支成员，和崇祯帝的血缘关系极为疏远。崇祯帝是明太祖朱元璋的第十一世孙、太祖第四子成祖朱棣的十世孙；而隆武帝、绍武帝则是明太祖朱元璋的九世孙、太祖第二十三子唐定王朱桱的八世孙。从辈分上看，隆武帝、绍武帝兄弟和明神宗万历帝同辈，是崇祯帝、弘光帝、永历帝的族叔祖。
崇祯帝和隆武帝、绍武帝之间的血缘关系，要上溯到明太祖那里，才是出自同一血脉的传承。因此，南明四位皇帝中，弘光帝、永历帝和崇祯帝的血缘关系最近，而隆武帝、绍武帝和崇祯帝之间血缘关系已经非常疏远，按照民间习惯，是“出了五服”后“再出三服”，从宗法上来说，和陌生人也没多大区别了。而弘光帝、永历帝两人之间、再论和崇祯帝的关系远近的话，弘光帝之父福忠王是明神宗第三子，永历帝之父桂端王是明神宗第七子，按照“伦序世系”的标准，弘光帝相比永历帝，和崇祯帝的行辈关系还要更近，这也是他在崇祯帝自尽殉国后，即使和东林文臣们有着超过四十年的公私龃龉、过节，但一样凭着和崇祯帝最亲近的血缘、伦序关系，被拥立为南明第一代皇帝的原因。
